microRNA (micros = griech. klein), abgekürzt miRNA, sind kurze Ribonukleinsäure (RNA)-Moleküle, die eine wichtige Rolle in dem komplexen Netzwerk der Genregulation, insbesondere beim Gen-Silencing spielen. Sie binden spezifisch an mRNA (messenger RNA) und kontrollieren die Genexpression durch Regulation der mRNA-Stabilität und der Translation. microRNAs wurden 1993 erstmals beschrieben, der Name wurde jedoch erst 2001 geprägt.

Die Gene für die miRNAs sind im Genom kodiert. Die verschiedenen miRNAs werden durch ein komplexes Polymerase-Splicing-System im Zellkern gebildet, processiert, in das Zytosol transportiert und dort letzendlich mit einer Länge von 17 bis 24 Nukleotiden aus der prä-miRNA herausgeschnitten werden. Heutzutage sind bis zu 932 unterschiedliche, menschliche microRNA-Sequenzen bekannt. Die maximale Anzahl humaner miRNAs wird auf ca. 1000 geschätzt. Diese microRNAs regulieren die Expression der mRNAs auf vielfältige Weise. Ein einzelnes Gen kann von zu 9 microRNAs reguliert werden. Auf der andere Seite können bestimmte microRNAs die Expression von mehrere Hundert verschiedenen Genen beeinflussen. Die Entschlüsselung von Gen-microRNA-Netzwerken ist eine aktuelle Anforderung an die moderne Genomforschung. Dies kann nur durch bioinformatorisches Abgleichen von parallel durchgeführten microRNA Profiling und Whole Genome Arrays erfolgen.

Whole Genome Arrays für exprimierte humane Gene müssen ca. 25.000 verschiedene mRNA umfassen. Nur hierdurch läßt sich die differentielle Expression einzelner Gene in zwei Proben bestimmen. Im Gegensatz hierzu werden von den bisher ca. 932 bekannten, humanen miRNAs nur eine limitierte Anzahl davon in einzelnen Geweben erwartet und für eine spätere Differentialanalyse benötigt.

Für den Nachweis der sehr kurzen miRNAs biete das IKDT Labor zwei Methoden an:

1. Die semiquantitative Bestimmung
von microRNA Profilen mit GENIOM microRNA Biochips (Fa. febit biomed, Heidelberg)

oder

2. Die quantitative Messung
von microRNA Profilen mit TaqMan ® microRNA Low-Density-Arrays (TLDA) auf Micro-Fluidic-Cards

Für beide Methoden ist eine spezielles Processing der RNA-Proben empfehlenswert.

Der Nachweis der sehr kurzen miRNAs kann direkt, nach entsprechendem Labeling mit speziellen Farbstoffen, mit GENIOM Biochips (Fa. febit biomed) oder nach vorheriger Amplifikation mit der TLDA-Methode (Fa. Applied Biosystems) erfolgen.

Die GENIOM Biochips enthalten 8 Arrays mit derzeit jeweils bis zu 15.000 Sonden. In naher Zukunft werden in einem Array bis zu 40.000 Sonden platzierbar sein.
Die GENIOM microRNA Biochips enthalten immer die Sonden für die neueste Version von allen von der Sanger mirbase Datenbank publizierten, humanen microRNAs (derzeit 932). Auf einem Chip werden 8 einzelne Proben parallel analysiert werden. Die microRNAs werden direkt markiert und ohne Voramplifikation nachgewiesen.

Sie liefern uns Ihre biologische Probe. Das Markieren der microRNAs, die Hybridisierung und die Messung führt das IKDT Labor durch. Die Daten werden Ihnen danach elektronisch übermittelt. Wenn Sie es wünschen, bekommen Sie eine kurze Vorauswertung Ihrer microRNA-Daten.

Auch hier können Sie dank der TaqMan Gene Expression Assay-Technologie(verlinken mit unten) von Applied Biosystems für jede humane microRNA ein optimiertes TaqMan-QPCR-System sofort bestellen und selektiv spezifische microRNA quantitativ in größeren Probenzahlen nachbestimmen

Nutzen Sie die TaqMan ® Low-Density-Arrays und bestimmen Sie quantitativ die Expression von den 667 häufigsten, humanen microRNAs in einer Probe.

Derzeit sind die Sequenzen von 932 menschlichen microRNAs bekannt. Für das microRNA Profiling wurde ein neues TaqMan ® Low-Density-Arrays Set (siehe Abb. A) für die Messung der 667 häufigsten, humanen microRNAs entwickelt. Auf zwei Micro-Fluidic-Cards wurden je 377 (Pool 1) und 290 (Pool 2) kombiniert und erlauben die zeitgleiche und parallele Bestimmung der gewünschten microRNAs aus einer biologischen Probe. Sie können Ihre Proben auch nur auf einen von beiden Pools (A oder B) screenen.

Dank der TaqMan Gene Expression Assay-Technologie von Applied Biosystems können Sie dann für jede humane microRNA ein optimiertes TaqMan-QPCR-System sofort bestellen und selektiv spezifische microRNA quantitativ in größeren Probenzahlen nachbestimmen.
Diese quantitativen TaqMan ® Assays sind auch für microRNAs in Maus, Ratte und anderen Spezies verfügbar.

Prä-Amplifikation der microRNAs

Sollten Sie wenig Probenmaterial zur Verfügung haben oder sehr schwach exprimierte microRNAs erwarten, läßt sich eine zusätzliche Prä-Amplifikation der microRNAs durchführen. Hierdurch erhöht sich die Sensitivität der Methode und es läßt sich die Menge an auswertbaren Probenmaterial auch für weiterführende Untersuchungen vergrößern.

Wir können für Sie einzelne microRNAs quantitativ bestimmen oder Sie wünschen das komplette Profiling mit den TaqMan microRNA Low Density Arrays (667 humane microRNAs).

Was brauchen wir von Ihnen? 1. Benennung interessanter microRNAs für Ihr Problem oder Bestellen Sie das microRNA profiling Was müssen Sie entscheiden? 2. Es soll eine Prä-Amplifikation durchgeführt werden! Was tun wir für Sie? 3. Auswahl Ihrer microRNAs für die TaqMan QPCR 4. Isolation der miRNA aus Ihrer Probe 5. Umschreiben der miRNA in cDNA 6. Prä-Amplifikation der Probe (optional) 7. Durchführung der TaqMan-QPCR im IKDT 8. Übermittlung der Expressionsdaten an Sie 9. Rückgabe oder Lagerung Ihrer prä-amplifzierten Proben (Schritte 4 und 5 können auch durch Sie ausgeführt werden) Vorteile für Sie: